小鼠活体成像实验操作规范备忘录：伦理、严谨与关怀

小鼠活体成像实验操作规范备忘录

各位年轻的科研工作者：

每每看到如今科研界一味追求速度，而忽略实验本身的严谨与对生命的尊重，我这心里就如鲠在喉。遥想当年，恩师常常教诲我们“格物致知，诚意正心”，做科研，先做人。今天，我这老朽就将我多年来在病理学领域的一些经验，特别是关于小鼠活体成像实验的操作规范，整理成这份备忘录，希望能对你们有所裨益。希望你们能真正理解科研的真谛，不负韶华，做出真正有价值的成果。

1. 绪论：伦理与责任

《希波克拉底誓言》有云：“我将为病人谋幸福，并避免一切蓄意的错误和伤害”。虽然我们面对的是实验动物，但同样要秉持着这样的信念。动物实验是科学研究的重要组成部分，但绝非毫无约束。我们要时刻牢记3R原则：替代 (Replacement)，减少 (Reduction)，优化 (Refinement)。在进行小鼠活体成像实验前，务必认真审查实验方案的必要性，是否有其他非动物实验方法可以替代？实验所需的动物数量是否已优化到最少？实验过程中是否采取了措施来减轻动物的痛苦？

务必遵守《实验动物管理条例》等相关法规，以及机构的伦理审查委员会的规定。实验方案必须经过伦理委员会的批准，并获得书面许可。对于实验可能造成的痛苦，必须进行充分评估，并采取有效的镇痛、麻醉措施。切记，我们是科研人员，不是施虐者。对生命的尊重，是科研的底线。

2. 实验准备：一丝不苟

“工欲善其事，必先利其器”。实验的成功，离不开充分的准备。以下是小鼠活体成像实验所需的材料、设备和试剂清单，务必逐一核对，确保万无一失：

• 成像系统： 确保成像系统的型号、波长范围、灵敏度等指标符合实验要求。定期进行校准和维护，确保其处于最佳工作状态。例如，IVIS Spectrum 成像系统，需要定期检查滤光片、光源等部件。
• 麻醉系统： 使用异氟烷等吸入式麻醉系统，能更精确地控制麻醉深度，减少对动物的生理干扰。确保麻醉气体浓度、流量等参数设置正确。配备氧气供应装置，以备不时之需。
• 加热垫： 维持动物体温，防止麻醉引起的体温下降。使用可调温加热垫，并将温度控制在37℃左右。
• 生理监测仪： 监测动物的呼吸、心率、血氧饱和度等生理指标，及时发现和处理异常情况。例如，SA Instruments 的生理监测仪，可以实时显示动物的各项生理参数。
• 注射器、针头： 选择合适的规格，确保无菌。使用一次性注射器和针头，防止交叉感染。
• 生理盐水、麻醉剂、镇痛剂： 确保试剂的质量和有效期。麻醉剂的选择，应根据实验的具体情况和动物的生理状况进行选择。常用的麻醉剂包括异氟烷、戊巴比妥钠等。镇痛剂的选择，应根据疼痛程度进行选择。常用的镇痛剂包括布托啡诺、美洛昔康等。
• 荧光染料或发光底物： 根据实验目的选择合适的染料或底物。例如，D-Luciferin 是常用的生物发光底物。确保染料或底物的浓度和纯度符合实验要求。
• 其他： 纱布、棉签、碘伏、酒精、剪刀、镊子等。

所有试剂的配制和储存必须严格按照标准操作规程进行，避免污染和变质。设备的校准记录、试剂的批号和有效期等信息，都应详细记录在实验记录本上，以备查验。

3. 动物准备：关怀备至

“医者父母心”，对待实验动物，我们也要像对待自己的孩子一样，给予充分的关怀。以下是动物准备的注意事项：

• 动物选择： 选择健康、无特定病原体 (SPF) 级的小鼠。根据实验目的选择合适的品系和年龄。常用的品系包括BALB/c、C57BL/6等。年龄一般选择6-8周龄的成年小鼠。
• 饲养条件： 提供清洁、干燥、通风的饲养环境。保持适宜的温度和湿度。提供充足的食物和饮水。定期更换垫料，保持笼具清洁。执行12小时光照/12小时黑暗循环。
• 适应性训练： 在实验前，让动物适应实验环境和操作流程。例如，可以每天将动物放入成像系统中，让其逐渐适应。操作人员应轻柔地对待动物，避免粗暴操作。
• 健康检查： 在实验前，对动物进行充分的健康检查，确保其符合实验要求。观察动物的精神状态、食欲、毛发光泽等。检查动物是否有呼吸道感染、皮肤病等疾病。如有异常，应及时处理或排除。
• 麻醉选择： 麻醉是活体成像实验中必不可少的环节。麻醉剂的选择，应优先选择对动物损伤最小的方案。常用的麻醉剂包括异氟烷、戊巴比妥钠等。异氟烷的优点是麻醉深度可控，苏醒快，对动物的生理干扰小。戊巴比妥钠的优点是麻醉效果稳定，但苏醒慢，对动物的呼吸和循环系统有一定抑制作用。务必根据实验的具体情况和动物的生理状况进行选择。
• 麻醉剂量和时间： 严格控制麻醉剂量和时间，避免麻醉意外。麻醉剂量应根据动物的体重进行计算。麻醉时间应尽量缩短，以减少对动物的生理干扰。在麻醉过程中，应密切关注动物的生理指标，如呼吸、心率和体温，及时调整麻醉剂量和时间。

4. 成像过程：精益求精

成像过程是活体成像实验的关键环节，每一个细节都可能影响实验结果。以下是成像过程的操作步骤：

1. 动物麻醉： 将动物放入诱导盒中，通入异氟烷气体进行麻醉。麻醉浓度一般为3-5%。待动物完全麻醉后，将其取出，并固定在成像平台上。
2. 参数设置： 根据实验目的设置成像参数。例如，曝光时间、滤光片、视野大小等。曝光时间应根据信号强度进行调整。滤光片的选择应根据染料或底物的激发和发射波长进行选择。视野大小应根据目标区域进行调整。
3. 图像采集： 开始图像采集。在采集过程中，应密切关注动物的生理指标，如呼吸、心率和体温。如有异常，应及时停止采集，并采取相应措施。
4. 数据处理： 对采集到的图像进行处理。例如，背景扣除、图像校正、信号定量等。背景扣除可以去除图像中的噪声。图像校正可以校正图像中的畸变。信号定量可以计算目标区域的信号强度。

在成像过程中，可能会出现一些伪影和干扰因素。例如，动物的毛发、皮肤色素、呼吸运动等。对于这些伪影和干扰因素，必须进行充分的分析和排除。可以采取以下措施：

• 剃除动物的毛发。
• 使用透光膜覆盖动物的皮肤。
• 使用呼吸门控技术，减少呼吸运动的影响。

5. 数据分析：客观严谨

数据分析是实验的最后一步，也是至关重要的一步。“盖棺定论”，数据的分析结果，直接决定了实验的结论。因此，必须保证数据分析的客观性和严谨性，避免主观臆断和选择性报告。数据分析应遵循以下原则：

• 原始数据： 保留完整的原始数据，不得随意篡改或删除。
• 统计方法： 选择合适的统计方法进行数据分析。例如，t检验、方差分析等。统计方法的选择，应根据数据的类型和分布进行选择。使用专业的统计软件进行数据分析，如GraphPad Prism、SPSS等。
• 结果呈现： 清晰、准确地呈现实验结果。使用图表、表格等形式，直观地展示数据。图表的标题、坐标轴标签、图例等应清晰明了。表格的表头、单位等应准确无误。
• 结果解释： 基于充分的证据和合理的推论，对实验结果进行解释。避免过度解读和主观臆断。将实验结果与其他研究结果进行比较和验证，以提高结论的可信度。
• 透明报告： 完整、透明地报告实验过程和结果。包括实验目的、材料、方法、结果和结论等。如实报告实验中遇到的问题和困难。公开实验数据和分析方法，接受同行评议。

6. 实验后处理：善始善终

“靡不有初，鲜克有终”，实验的结束，并不意味着任务的完成。实验后处理，同样需要认真对待。以下是实验结束后动物的处置方法：

• 安乐死： 对于需要安乐死的动物，必须选择人道的方式，尽量减少其痛苦。常用的安乐死方法包括二氧化碳吸入、颈椎脱臼、注射过量麻醉剂等。二氧化碳吸入是一种无痛、快速的安乐死方法。颈椎脱臼是一种快速、但可能引起动物恐惧的安乐死方法。注射过量麻醉剂是一种可靠、但可能引起动物呼吸抑制的安乐死方法。务必根据动物的种类、年龄和生理状况选择合适的安乐死方法。安乐死后，应确认动物已经死亡，才能进行后续处理。
• 术后护理： 对于需要术后护理的动物，必须提供良好的饲养条件和医疗保障，确保其尽快康复。提供清洁、干燥、温暖的饲养环境。提供充足的食物和饮水。定期检查伤口，防止感染。如有必要，可以使用抗生素、镇痛剂等药物。
• 记录： 详细记录实验后动物的处置情况，包括安乐死方法、术后护理措施等。记录动物的死亡时间、原因等。这些记录，不仅是实验资料的重要组成部分，也是对逝去生命的尊重。

7. 案例分析：前车之鉴

以下列举几个因为实验操作不规范或者伦理意识淡薄而导致实验失败甚至造成动物痛苦的案例，希望能给大家敲响警钟：

• 案例一： 某研究人员在进行小鼠肿瘤活体成像实验时，为了追求更高的信噪比，擅自增加了荧光染料的剂量。结果导致小鼠出现严重的毒性反应，甚至死亡。这个案例告诉我们，实验必须严格遵守操作规程，不得随意更改剂量和方法。在追求实验结果的同时，更要关注动物的健康和安全。
• 案例二： 某实验室在进行小鼠活体成像实验后，没有及时对动物进行安乐死，而是将其放回笼中。结果导致动物在痛苦中挣扎数小时后才死亡。这个案例告诉我们，对于需要安乐死的动物，必须及时进行处理，避免其遭受不必要的痛苦。安乐死是一种人道的选择，是对生命的尊重。
• 案例三： 某研究团队在进行小鼠活体成像实验时，没有对动物进行充分的麻醉，导致动物在成像过程中不断挣扎。这不仅影响了成像质量，也给动物带来了极大的痛苦。这个案例告诉我们，麻醉是活体成像实验中必不可少的环节。麻醉的目的是减轻动物的痛苦，保证实验的顺利进行。必须选择合适的麻醉剂和麻醉方法，并严格控制麻醉剂量和时间。

“殷鉴不远，在夏后之世”。这些案例，都是我们应该吸取的教训。只有从这些失败中学习，才能避免重蹈覆辙，做出更好的科研成果。

8. 参考文献：溯本求源

以下是一些与小鼠活体成像实验相关的参考文献，希望能帮助大家深入了解相关知识：

• 《实验动物管理条例》
• 《实验动物福利伦理审查指南》
• Theranostics. 2017; 7(6): 1661-1675. DOI: 10.7150/thno.18654
• Journal of Nuclear Medicine. 2016; 57(1): 131-137. DOI: 10.2967/jnumed.115.162711

各位年轻的科研工作者，科研之路漫漫，上下求索。希望你们能牢记伦理与责任，严谨操作，关怀生命，在科研的道路上越走越远，为人类的健康事业做出更大的贡献！